Technische ondersteuning van de celcultuur

1. Wat zijn de basiscomponenten van synthetisch medium (vloeistof)?

Hoewel er veel soorten synthetische media zijn, bevatten ze over het algemeen aminozuren, vitamines, suikers, anorganische ionen en enkele andere hulpcomponenten.

(1) Aminozuur: het is het hoofdbestanddeel van het synthetische medium en het essentiële aminozuur wordt voornamelijk gebruikt in het synthetische medium. Verschillende soorten cellen hebben verschillende vereisten voor aminozuren, maar er zijn verschillende soorten aminozuren die niet door de cellen zelf kunnen worden gesynthetiseerd en die door het kweekmedium moeten worden geleverd. Deze soorten aminozuren worden essentiële aminozuren genoemd. Onder hen is glutamine een essentieel aminozuur voor cellen om nucleïnezuren en eiwitten te synthetiseren.Wanneer glutamine ontbreekt, zullen cellen slecht groeien en afsterven.

( 2) Vitaminen: De meeste enzymen en co-enzymen in celgroei en metabolisme worden gevormd door vitamines. Hoewel serum in celkweek een belangrijke bron van vitamines is, worden veel media aangevuld met verschillende vitamines om de groei van meer cellijnen te ondersteunen.

(3) Koolhydraten: De koolhydraten in het medium omvatten glucose, ribose, deoxyribose, natriumpyruvaat, enz., Die voornamelijk energie leveren voor celgroei, en kunnen ook deelnemen aan de synthese van proteïne en nucleïnezuur.

(4) Anorganische ionen: het medium bevat anorganische zouten zoals kalium en natrium in een uitgebalanceerde zoutoplossing, en sommige medium bevat sporenelementen, zoals Fe2 +, Zn2 +, Ca2 +, enz.

(5) Overige ingrediënten: Soms kunnen metabolische tussenproducten, redoxmiddelen, adenosinetrifosfaat, co-enzym A, enz. Aan een paar synthetische media worden toegevoegd. Om aan de behoeften van sommige speciale culturen te voldoen, kunnen enkele nieuwe ingrediënten worden toegevoegd, zoals het DMEM-kweekmedium dat gewoonlijk wordt gebruikt in hybridomatechnologie, en bij gebruik moeten natriumpyruvaat en 2-mercaptoethanol worden toegevoegd.

2. Evenwichtige zoutoplossing

Evenwichtige zoutoplossing (BSS) is de basisvloeistof die gewoonlijk wordt gebruikt in weefselcelkweek. Het kan de osmotische druk handhaven, de pH aanpassen en energie en anorganische ioncomponenten leveren die nodig zijn voor celoverleving. Hoofdzakelijk gebruikt als de basisvloeistof van synthetisch medium (vloeistof) en gebruikt om weefsels, cellen, enz. Veelgebruikte gebalanceerde zoutoplossingen zijn onder meer PBS, Hanks-oplossing (HBSS) en D-Hanks-oplossing. Het belangrijkste verschil tussen verschillende uitgebalanceerde zoutoplossingen ligt in de concentratie van natriumchloride, ionenconcentratie en buffersysteem.U kunt een geschikte uitgebalanceerde zoutoplossing kiezen op basis van uw behoeften.

3. Spijsverteringssap

Als u weefsels en cellen in de primaire cultuur wilt verspreiden en als u cellen tijdens het passeren van aangehechte substraten wilt losmaken, heeft u spijsverteringssap nodig. De verteringsoplossing die gewoonlijk wordt gebruikt in weefselcelkweek is trypsine en EDTA, die alleen of gemengd kunnen worden gebruikt.

Trypsine is een hydrolytisch enzym dat wordt geïsoleerd uit de alvleesklier van dieren en heeft als belangrijkste functie het hydrolyseren en verspreiden van het eiwit tussen cellen. Het vermogen van trypsine om cellen te scheiden is gerelateerd aan celtypen en celeigenschappen.Verschillende soorten cellen en verschillende aantallen cellen gebruiken trypsine voor verschillende verteringstijden. De hoge concentratie, hoge temperatuur en nieuw bereide trypsine kan celscheiding versnellen. De trypsine-oplossing heeft het sterkste effect wanneer de pH 8,0 is en de temperatuur 37 ° C.

Opmerking: de aanwezigheid van calciumionen, magnesiumionen en serumeiwitten zal de trypsine-activiteit verminderen. Bij het verteren van cellen kan het toevoegen van wat serum of serum-bevattend kweekmedium of trypsineremmer de vertering van trypsine op cellen stoppen.

Bewaarcondities: De bereide trypsine-oplossing moet in een koelkast bij -20 ° C worden bewaard om ontleding en mislukking te voorkomen.

Gebruik de vloeibare trypsine-oplossing die in de koelkast is bewaard bij 4 ° C binnen een week na oplossen

EDTA is een chemisch chelaatvormer waarvan de belangrijkste functie is om Ca2 + en Mg2 + te cheleren om cellen te scheiden en weinig toxisch te zijn voor cellen. De meest gebruikte concentratie is 0,02%.

Het gecombineerde gebruik van trypsine en EDTA kan de spijsverteringsefficiëntie verbeteren, maar er moet worden opgemerkt dat EDTA niet kan worden geneutraliseerd door serum. Na gebruik van EDTA om cellen te behandelen, moet u ze spoelen met een Hanks-oplossing, omdat resterende EDTA de celgroei zal beïnvloeden.

4. Hoe kan ik vloeibaar kweekmedium bewaren?

(1) Het vloeibare kweekmedium moet in een koelkast bij 4 ° C en beschermd tegen licht worden bewaard en vóór gebruik op 37 ° C worden voorverwarmd.

(2) De opslagperiode van vloeibaar medium zonder serum is 12 maanden en de periode van vloeibare kweek en opslag met serum is 6 maanden.

(3) L-glutamine in het vloeibare medium zal langzaam ontleden naarmate de opslagtijd toeneemt. Als de cellen slecht groeien, kunt u een geschikte hoeveelheid L-glutamine toevoegen.

5. Kan het vloeibare medium per ongeluk worden ingevroren, kan ik het blijven gebruiken?

Als het celkweekmedium per ongeluk wordt ingevroren, moet u het kweekmedium ontdooien en op neerslag letten. Als er geen neerslag optreedt, kan het medium normaal worden gebruikt, als er wel neerslag optreedt, kan het medium alleen worden weggegooid.

6. Kunnen het medium en andere additieven en reagentia herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid?

De meeste additieven en reagentia kunnen tot 3 keer worden ingevroren en ontdooid, als dit vaker gebeurt, zal dit een bepaalde mate van afbraak en neerslag veroorzaken in de eiwithoudende oplossing, wat de prestaties zal beïnvloeden.

7. Waarom moet fenolrood uit sommige kweekmedia worden verwijderd?

Fenolrood wordt gebruikt als een pH-indicator in het kweekmedium. Roze staat voor neutrale pH, geel staat voor zure pH en paars staat voor alkalische pH. Fenolrood heeft echter bepaalde steroïdhormoonachtige effecten, zoals oestrogeenachtige effecten, vooral voor de gekweekte zoogdiercellen, de mogelijke sterolreactie kan niet worden genegeerd. Om te voorkomen dat fenolrood de testresultaten verstoort, kiezen veel onderzoekers afhankelijk van de situatie of ze fenolroodhoudende media gebruiken.

8. Wat is de rol van natriumpyruvaat in het medium?

Cellen gebruiken gewoonlijk glucose als koolstofbron en natriumpyruvaat kan worden gebruikt als alternatieve koolstofbron in celkweek. Als er niet voldoende glucosevoorraad is, zullen cellen natriumpyruvaat als metabolisch substraat kiezen.

9. Wat zijn de voordelen van het toevoegen van HEPES aan het medium ?

Het meest gebruikte buffersysteem in kweekmedia is bicarbonaat, dat voedingsstoffen kan leveren, maar de buffercapaciteit onder fysiologische pH-omstandigheden zal verminderen. En HEPES is een sterk buffermiddel, dat de buffercapaciteit van celkweekmedia onder pH 7,2-7,6 condities kan verbeteren.

10. Veel gestelde vragen over serum

Serum is een van de belangrijkste elementen in celkweek. Daarom hebben we een aantal veelvoorkomende problemen in het laboratorium speciaal voor uw referentie opgelost:

(1) De beste manier om serum te bewaren?

We raden aan om het serum te bewaren bij -5 ° C tot -20 ° C. Serum dat lang moet worden bewaard, moet worden bewaard in een lage temperatuur koelkast bij -20 ° C tot -70 ° C. Indien bewaard bij 4 ° C, niet langer dan een maand bewaren. Als u niet één fles tegelijk kunt gebruiken, is het raadzaam het serum aseptisch te verdelen in een geschikte gesteriliseerde container en het terug in de vriezer te plaatsen. Aangezien het serumvolume bij bevriezing met ongeveer 10% toeneemt, moet een bepaald volume aan ruimte worden gereserveerd voordat het serum wordt ingevroren in de lage-temperatuurkoelkast, anders is het vatbaar voor vervuiling of bevriezing van glazen flessen.

(2) Hoe het serum te ontdooien om de productkwaliteit niet te beschadigen?

We raden u aan om de methode van geleidelijk ontdooien te gebruiken: haal het serum uit de koelkast met lage temperatuur bij -20 ° C tot -70 ° C en plaats het in de koelkast bij 2 ° C-8 ° C om het te ontdooien en verplaats het vervolgens naar kamertemperatuur om het op te lossen voordat u het vult. Schud tijdens het oplossingsproces voorzichtig en regelmatig (zorg ervoor dat u geen bellen veroorzaakt) om de temperatuur en samenstelling uniform te maken en het optreden van neerslag te verminderen. Het serum niet direct ontdooien van -20 ° C tot 37 ° C, aangezien de temperatuur te veel verandert, wat kan leiden tot eiwitaggregatie en neerslag.

(3) Wat moet ik doen nadat het serum is ontdooid, vlokkig sediment wordt gevonden?

Er zijn veel redenen voor het verschijnen van sedimenten in het serum, maar de meest voorkomende oorzaak is de denaturatie van lipoproteïnen in het serum Fibrine (een van de eiwitten die de bloedstolling veroorzaken) zal na ontdooien ook in het bloed aanwezig zijn. In het serum is het ook een van de belangrijkste oorzaken van neerslag. Maar deze vlokkige sedimenten hebben geen invloed op de kwaliteit van het serum zelf.

Als u deze vlokkige sedimenten wilt verwijderen, kunt u het serum in een steriele centrifugebuis verdelen, het lichtjes centrifugeren bij 400 g en vervolgens het supernatant aan het kweekmedium toevoegen en het samen filteren. We raden u af om filtratie te gebruiken om deze vlokkige sedimenten te verwijderen, omdat dit uw filtermembraan kan verstoppen.

(4) Wat is warmte-inactivering?

Over het algemeen wordt het ontdooide serum gedurende 30 minuten bij 56 ° C verwerkt, omdat deze verwarmingsstap complement kan deactiveren, en de reacties die betrokken zijn bij complement omvatten: cytolytische activiteit, samentrekking van gladde spieren, afgifte van histamine uit mestcellen en bloedplaatjes, Verbeter fagocytose, chemotaxis en activering van lymfocyten en macrofagen.

(5) Is het nodig om warmte-inactivering uit te voeren?

Experimenten hebben aangetoond dat door warmte geïnactiveerd serum dat op de juiste manier is verwerkt, voor de meeste cellen niet nodig is. Het serum na deze behandeling bevordert slechts in geringe mate de celgroei, of heeft helemaal geen effect, zelfs meestal omdat de behandeling bij hoge temperatuur de kwaliteit van het serum beïnvloedt, waardoor de celgroei afneemt. In het hittebehandelde serum zal de vorming van precipitaten aanzienlijk toenemen. Deze precipitaten zien er, wanneer ze onder een omgekeerde microscoop worden bekeken, uit als “kleine zwarte vlekken”, waardoor onderzoekers vaak ten onrechte denken dat het serum besmet is en brengen ze het serum in 37 In een omgeving van ℃ zal het sediment toenemen, waardoor onderzoekers ten onrechte denken dat het de deling en versterking van micro-organismen is.

Daarom raden we aan dat u de warmtebehandelingsstap niet hoeft uit te voeren als dit niet nodig is. Zo bespaart u niet alleen uw kostbare tijd, maar zorgt u ook voor de kwaliteit van het serum!

(6) Hoe voorkom je neerslag?
We raden je aan om bij het gebruik van serum op de volgende handelingen te
letten : ① Volg bij het ontdooien van serum de aanbevolen methode voor geleidelijk ontdooien (-20 ° C tot 4 ° C tot kamertemperatuur). De temperatuur veranderde teveel tijdens het ontdooien (zoals -20 ° C tot 37 ° C), het is heel gemakkelijk om neerslag te produceren.
② Schud het serum bij het ontdooien op elk moment gelijkmatig om de temperatuur en samenstelling uniform te maken en het optreden van neerslag te verminderen.
③Laat het serum niet te lang op 37 ° C staan. Als het serum te lang op 37 ° C wordt bewaard, wordt het troebel en worden veel meer onstabiele componenten in het serum ook beschadigd, wat de kwaliteit van het serum beïnvloedt.
④De hitte-inactivering van serum is zeer gemakkelijk om de toename van sediment te veroorzaken.Als het niet nodig is, is deze stap niet nodig.
⑤ Als het nodig is om het serum door warmte te deactiveren, volg dan het principe van 56 ° C gedurende 30 minuten en schud het op elk moment gelijkmatig. Een te hoge temperatuur, te lange tijd of ongelijkmatig schudden zal leiden tot toename van bezinksel.