De volgende gids dient als checklist voor de mogelijke oorzaken en oplossingen met betrekking tot enkele van de meest voorkomende problemen van de Western-blot-assays.

1. Hoge achtergrond

   S.No.	Mogelijke oorzaak	Oplossing
   1	Te hoge antilichaamconcentratie	Optimaliseer en verlaag de antilichaamconcentratie
   2	Vorming van secundaire antilichaamvorming	Filtreer het secundaire antilichaam door een filter van 0,2 μm Gebruik een nieuw secundair antilichaam
   3	Te hoge incubatietemperatuur van antilichamen	Incubeer het antilichaam bij 4 ° C
   4	Niet-specifieke secundaire antilichaambinding of kruisreactiviteit met blokkerende stof	Voer secundaire antilichaamcontrole uit (zonder de primaire) Verlaag de concentratie van secundair antilichaam
   5	Kruisreactiviteit van primair of secundair antilichaam met blokkerende stof	Voeg Tween-20 toe aan de incubatie- en wasbuffer
   6	Incompatibele blokkerende stof	Vergelijk verschillende blokkeerbuffers
   7	Onvolledige blokkering	Optimaliseer de keuze van de blokkeerbuffer Verhoog de eiwitconcentratie in het blokkerende middel Blokkeringstijd en / of temperatuur optimaliseren; Blokkeer 2 uur bij normale temperatuur of ’s nachts bij 4 ° C Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan het blokkeermiddel Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan de oplossing van antilichaamverdunners
   8	Onvoldoende blokkering	Verleng de blokkeertijd of gebruik een compatibel blokkeermiddel (bijv. Magere melk, BSA, serum, enz.)
   9	Kruisreactiviteit van antilichaam met andere eiwitten	Gebruik een ander blokkeringsmiddel (Gebruik geen magere melk met biotinesysteem Verlaag de concentratie van secundair antilichaam Test kruisreactiviteit tussen secundair antilichaam en membraan
   10	Onvoldoende wassen	Verhoog het aantal wasbeurten en het buffervolume Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan de wasbuffer
   11	Te lange belichtingstijd	Verkort de belichtingstijd
   12	Membraanprobleem	Gebruik een schoon pincet; Bedien met handschoenen Gebruik nieuwe membranen Zorg ervoor dat de vloeistof voldoende is om het membraan vochtig te houden Gebruik de ontkleuringstabel tijdens incubatie Vermijd overlappende membranen Voorzichtig hanteren en beschadiging van het membraan vermijden
   13	Onvoldoende membraanwas	Verhoog het aantal wasbeurten
   14	Onverenigbaar membraan	De achtergrond van nitrocellulosemembraan is lager dan die van PVDF-membraan
   15	Droog membraan	Zorg ervoor dat het membraan bedekt is met voldoende vloeistof en voorkom dat het uitdroogt
   16	Verontreinigde buffer	Gebruik voor gebruik een nieuwe buffer of filterbuffer
   17	Verontreinigde apparatuur	Zorg ervoor dat alle apparatuur en gereedschappen schoon zijn en dat er geen gel op het membraan achterblijft

2. Zwak / geen signaal

   S.No.	Mogelijke oorzaak	Oplossing
   1	Onjuiste eiwitoverdracht naar membraan	Vlekgel nadat de overdracht is voltooid om te bepalen of de overdracht efficiënt is Gebruik Ponceau S om het membraan te kleuren om te bepalen of de overdracht efficiënt is Zorg voor voldoende contact tussen gel en membraan tijdens overdracht Zorg ervoor dat de transfersandwich correct is gemonteerd Nat membraan volgens de instructie Vermijd oververhitting tijdens elektro-overdracht Gebruik positieve markeringen voor controle of molecuulgewicht Overdrachtstijd en -stroom optimaliseren Gebruik Boster’s membraanoverdrachtbuffer (AR1149) Vermijd vernietiging van monsters (antigene determinant) bij hantering
   2	Onvoldoende eiwit- en membraanbinding	20% methanol toevoegen aan de buffer Gebruik een membraan met kleine boring
   3	Onvoldoende antilichaam	Verhoog de antilichaamconcentratie
   4	Onvoldoende antigeen	Laad meer eiwitten
   5	Antigeen maskeren door buffer te blokkeren	Vergelijk verschillende blokkeerbuffers Optimaliseer de eiwitconcentratie van het blokkerende middel Verkort de blokkeertijd
   6	Aanwezigheid van natriumazide in buffers	Verwijder natriumazide uit buffers
   7	Te korte belichtingstijd	Verleng de belichtingstijd van de film
   8	Te korte incubatietijd van het substraat	Verleng de incubatietijd van het substraat tot vijf minuten
   9	Vertering van eiwitten op membraan	Optimaliseer de hoeveelheid blokkerende agent
   10	Afbraak van eiwitten tijdens opslag	Bereid het eiwitmonster opnieuw voor
   11	Incompatibele primaire en secundaire antilichamen	Zorg ervoor dat primair antilichaam, secundair antilichaam, substraat, enzymsysteem en monsters compatibel zijn Gebruik laadcontrole om de effectiviteit van het tweede detectiesysteem te testen
   12	Lage concentratie van primair antilichaam en / of secundair antilichaam	Verhoog de antilichaamconcentratie Verhoog de incubatietijd
   13	Kruisreactiviteit tussen blokkerende stof en antilichamen (primair of secundair)	Gebruik een mild schoonmaakmiddel zoals Tween20 Veranderingsblokker (vaak gebruikt zijn melk, BSA, serum of gelatine)
   14	Onvermogen van primair antilichaam om het eiwit in het geteste monster te herkennen	Controleer instructie Gebruik positieve controle
   15	Laag of geen gehalte aan doeleiwit (ineffectief antigeen)	Gebruik positieve controle Verhoog de laadhoeveelheid tot 20-30 µg eiwit per putje Gebruik proteaseremmer of fractionele extract-doeleiwit
   16	Onvoldoende overdracht en overmatig wassen	Controleer de overdracht met Ponceau S Week PVDF-membraan in methanol Vermijd overmatig wassen
   17	Overmatig blokkeren	Gebruik 0,05% magere melk of geen buffer met melkverdunners Verander blokkerende agent Verkort de blokkeertijd
   18	Verlies van de effectiviteit van primaire antilichamen	Maak verse antilichamen klaar en bewaar ze op de juiste manier wanneer ze niet worden gebruikt Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien
   19	Remming van secundair antilichaam door natriumazide	Vermijd het gebruik van natriumazide samen met aan HRP geconjugeerde antilichamen
   20	Verlies van effectiviteit in enzymconjugaat en substraat	Meng enzymconjugaat en substraat (geen kleurontwikkeling wanneer enzym inactief is) Gebruik geactiveerd enzymconjugaat en vers substraat
   21	Onjuiste natte overdracht voor membraan	Week het PVDF-membraan in 100% methanol
   22	Onvoldoende molecuulgewicht van doeleiwit (<10 kDa)	Gebruik een membraan met kleine boring Overdrachttijd verkorten
   23	Gelijkheid of nabijheid in waarden tussen het iso-elektrische punt van het doeleiwit en de pH-waarde van de transferbuffer	Probeer andere buffers zoals CAPS-buffer (pH 10,5) Probeer buffers met een lage pH-waarde, zoals azijnzuurbuffer
   24	Te hoge methanolconcentratie	Verlaag de methanolconcentratie of gebruik isopropylalcohol