Meest voorkomende problemen van de Western-blot-assays.

Contents

 

De volgende gids dient als checklist voor de mogelijke oorzaken en oplossingen met betrekking tot enkele van de meest voorkomende problemen van de Western-blot-assays.

  1. Hoge achtergrond

    S.No. Mogelijke oorzaak Oplossing
    1 Te hoge antilichaamconcentratie
    • Optimaliseer en verlaag de antilichaamconcentratie
    2 Vorming van secundaire antilichaamvorming
    • Filtreer het secundaire antilichaam door een filter van 0,2 μm
    • Gebruik een nieuw secundair antilichaam
    3 Te hoge incubatietemperatuur van antilichamen
    • Incubeer het antilichaam bij 4 ° C
    4 Niet-specifieke secundaire antilichaambinding of kruisreactiviteit met blokkerende stof
    • Voer secundaire antilichaamcontrole uit (zonder de primaire)
    • Verlaag de concentratie van secundair antilichaam
    5 Kruisreactiviteit van primair of secundair antilichaam met blokkerende stof
    • Voeg Tween-20 toe aan de incubatie- en wasbuffer
    6 Incompatibele blokkerende stof
    • Vergelijk verschillende blokkeerbuffers
    7 Onvolledige blokkering
    • Optimaliseer de keuze van de blokkeerbuffer
    • Verhoog de eiwitconcentratie in het blokkerende middel
    • Blokkeringstijd en / of temperatuur optimaliseren; Blokkeer 2 uur bij normale temperatuur of ’s nachts bij 4 ° C
    • Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan het blokkeermiddel
    • Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan de oplossing van antilichaamverdunners
    8 Onvoldoende blokkering
    • Verleng de blokkeertijd of gebruik een compatibel blokkeermiddel (bijv. Magere melk, BSA, serum, enz.)
    9 Kruisreactiviteit van antilichaam met andere eiwitten
    • Gebruik een ander blokkeringsmiddel (Gebruik geen magere melk met biotinesysteem
    • Verlaag de concentratie van secundair antilichaam
    • Test kruisreactiviteit tussen secundair antilichaam en membraan
    10 Onvoldoende wassen
    • Verhoog het aantal wasbeurten en het buffervolume
    • Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan de wasbuffer
    11 Te lange belichtingstijd
    • Verkort de belichtingstijd
    12 Membraanprobleem
    • Gebruik een schoon pincet; Bedien met handschoenen
    • Gebruik nieuwe membranen
    • Zorg ervoor dat de vloeistof voldoende is om het membraan vochtig te houden
    • Gebruik de ontkleuringstabel tijdens incubatie
    • Vermijd overlappende membranen
    • Voorzichtig hanteren en beschadiging van het membraan vermijden
    13 Onvoldoende membraanwas
    • Verhoog het aantal wasbeurten
    14 Onverenigbaar membraan
    • De achtergrond van nitrocellulosemembraan is lager dan die van PVDF-membraan
    15 Droog membraan
    • Zorg ervoor dat het membraan bedekt is met voldoende vloeistof en voorkom dat het uitdroogt
    16 Verontreinigde buffer
    • Gebruik voor gebruik een nieuwe buffer of filterbuffer
    17 Verontreinigde apparatuur
    • Zorg ervoor dat alle apparatuur en gereedschappen schoon zijn en dat er geen gel op het membraan achterblijft
  2. Zwak / geen signaal

    S.No. Mogelijke oorzaak Oplossing
    1 Onjuiste eiwitoverdracht naar membraan
    • Vlekgel nadat de overdracht is voltooid om te bepalen of de overdracht efficiënt is
    • Gebruik Ponceau S om het membraan te kleuren om te bepalen of de overdracht efficiënt is
    • Zorg voor voldoende contact tussen gel en membraan tijdens overdracht
    • Zorg ervoor dat de transfersandwich correct is gemonteerd
    • Nat membraan volgens de instructie
    • Vermijd oververhitting tijdens elektro-overdracht
    • Gebruik positieve markeringen voor controle of molecuulgewicht
    • Overdrachtstijd en -stroom optimaliseren
    • Gebruik Boster’s membraanoverdrachtbuffer (AR1149)
    • Vermijd vernietiging van monsters (antigene determinant) bij hantering
    2 Onvoldoende eiwit- en membraanbinding
    • 20% methanol toevoegen aan de buffer
    • Gebruik een membraan met kleine boring
    3 Onvoldoende antilichaam
    • Verhoog de antilichaamconcentratie
    4 Onvoldoende antigeen
    • Laad meer eiwitten
    5 Antigeen maskeren door buffer te blokkeren
    • Vergelijk verschillende blokkeerbuffers
    • Optimaliseer de eiwitconcentratie van het blokkerende middel
    • Verkort de blokkeertijd
    6 Aanwezigheid van natriumazide in buffers
    • Verwijder natriumazide uit buffers
    7 Te korte belichtingstijd
    • Verleng de belichtingstijd van de film
    8 Te korte incubatietijd van het substraat
    • Verleng de incubatietijd van het substraat tot vijf minuten
    9 Vertering van eiwitten op membraan
    • Optimaliseer de hoeveelheid blokkerende agent
    10 Afbraak van eiwitten tijdens opslag
    • Bereid het eiwitmonster opnieuw voor
    11 Incompatibele primaire en secundaire antilichamen
    • Zorg ervoor dat primair antilichaam, secundair antilichaam, substraat, enzymsysteem en monsters compatibel zijn
    • Gebruik laadcontrole om de effectiviteit van het tweede detectiesysteem te testen
    12 Lage concentratie van primair antilichaam en / of secundair antilichaam
    • Verhoog de antilichaamconcentratie
    • Verhoog de incubatietijd
    13 Kruisreactiviteit tussen blokkerende stof en antilichamen (primair of secundair)
    • Gebruik een mild schoonmaakmiddel zoals Tween20
    • Veranderingsblokker (vaak gebruikt zijn melk, BSA, serum of gelatine)
    14 Onvermogen van primair antilichaam om het eiwit in het geteste monster te herkennen
    • Controleer instructie
    • Gebruik positieve controle
    15 Laag of geen gehalte aan doeleiwit (ineffectief antigeen)
    • Gebruik positieve controle
    • Verhoog de laadhoeveelheid tot 20-30 µg eiwit per putje
    • Gebruik proteaseremmer of fractionele extract-doeleiwit
    16 Onvoldoende overdracht en overmatig wassen
    • Controleer de overdracht met Ponceau S
    • Week PVDF-membraan in methanol
    • Vermijd overmatig wassen
    17 Overmatig blokkeren
    • Gebruik 0,05% magere melk of geen buffer met melkverdunners
    • Verander blokkerende agent
    • Verkort de blokkeertijd
    18 Verlies van de effectiviteit van primaire antilichamen
    • Maak verse antilichamen klaar en bewaar ze op de juiste manier wanneer ze niet worden gebruikt
    • Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien
    19 Remming van secundair antilichaam door natriumazide
    • Vermijd het gebruik van natriumazide samen met aan HRP geconjugeerde antilichamen
    20 Verlies van effectiviteit in enzymconjugaat en substraat
    • Meng enzymconjugaat en substraat (geen kleurontwikkeling wanneer enzym inactief is)
    • Gebruik geactiveerd enzymconjugaat en vers substraat
    21 Onjuiste natte overdracht voor membraan
    • Week het PVDF-membraan in 100% methanol
    22 Onvoldoende molecuulgewicht van doeleiwit (<10 kDa)
    • Gebruik een membraan met kleine boring
    • Overdrachttijd verkorten
    23 Gelijkheid of nabijheid in waarden tussen het iso-elektrische punt van het doeleiwit en de pH-waarde van de transferbuffer
    • Probeer andere buffers zoals CAPS-buffer (pH 10,5)
    • Probeer buffers met een lage pH-waarde, zoals azijnzuurbuffer
    24 Te hoge methanolconcentratie
    • Verlaag de methanolconcentratie of gebruik isopropylalcohol