De volgende gids dient als checklist voor de mogelijke oorzaken en oplossingen met betrekking tot enkele van de meest voorkomende problemen van de Western-blot-assays.
-
Hoge achtergrond
S.No. Mogelijke oorzaak Oplossing 1 Te hoge antilichaamconcentratie - Optimaliseer en verlaag de antilichaamconcentratie
2 Vorming van secundaire antilichaamvorming - Filtreer het secundaire antilichaam door een filter van 0,2 μm
- Gebruik een nieuw secundair antilichaam
3 Te hoge incubatietemperatuur van antilichamen - Incubeer het antilichaam bij 4 ° C
4 Niet-specifieke secundaire antilichaambinding of kruisreactiviteit met blokkerende stof - Voer secundaire antilichaamcontrole uit (zonder de primaire)
- Verlaag de concentratie van secundair antilichaam
5 Kruisreactiviteit van primair of secundair antilichaam met blokkerende stof - Voeg Tween-20 toe aan de incubatie- en wasbuffer
6 Incompatibele blokkerende stof - Vergelijk verschillende blokkeerbuffers
7 Onvolledige blokkering - Optimaliseer de keuze van de blokkeerbuffer
- Verhoog de eiwitconcentratie in het blokkerende middel
- Blokkeringstijd en / of temperatuur optimaliseren; Blokkeer 2 uur bij normale temperatuur of ’s nachts bij 4 ° C
- Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan het blokkeermiddel
- Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan de oplossing van antilichaamverdunners
8 Onvoldoende blokkering - Verleng de blokkeertijd of gebruik een compatibel blokkeermiddel (bijv. Magere melk, BSA, serum, enz.)
9 Kruisreactiviteit van antilichaam met andere eiwitten - Gebruik een ander blokkeringsmiddel (Gebruik geen magere melk met biotinesysteem
- Verlaag de concentratie van secundair antilichaam
- Test kruisreactiviteit tussen secundair antilichaam en membraan
10 Onvoldoende wassen - Verhoog het aantal wasbeurten en het buffervolume
- Voeg 0,05% Tween 20 wasmiddel toe aan de wasbuffer
11 Te lange belichtingstijd - Verkort de belichtingstijd
12 Membraanprobleem - Gebruik een schoon pincet; Bedien met handschoenen
- Gebruik nieuwe membranen
- Zorg ervoor dat de vloeistof voldoende is om het membraan vochtig te houden
- Gebruik de ontkleuringstabel tijdens incubatie
- Vermijd overlappende membranen
- Voorzichtig hanteren en beschadiging van het membraan vermijden
13 Onvoldoende membraanwas - Verhoog het aantal wasbeurten
14 Onverenigbaar membraan - De achtergrond van nitrocellulosemembraan is lager dan die van PVDF-membraan
15 Droog membraan - Zorg ervoor dat het membraan bedekt is met voldoende vloeistof en voorkom dat het uitdroogt
16 Verontreinigde buffer - Gebruik voor gebruik een nieuwe buffer of filterbuffer
17 Verontreinigde apparatuur - Zorg ervoor dat alle apparatuur en gereedschappen schoon zijn en dat er geen gel op het membraan achterblijft
-
Zwak / geen signaal
S.No. Mogelijke oorzaak Oplossing 1 Onjuiste eiwitoverdracht naar membraan - Vlekgel nadat de overdracht is voltooid om te bepalen of de overdracht efficiënt is
- Gebruik Ponceau S om het membraan te kleuren om te bepalen of de overdracht efficiënt is
- Zorg voor voldoende contact tussen gel en membraan tijdens overdracht
- Zorg ervoor dat de transfersandwich correct is gemonteerd
- Nat membraan volgens de instructie
- Vermijd oververhitting tijdens elektro-overdracht
- Gebruik positieve markeringen voor controle of molecuulgewicht
- Overdrachtstijd en -stroom optimaliseren
- Gebruik Boster’s membraanoverdrachtbuffer (AR1149)
- Vermijd vernietiging van monsters (antigene determinant) bij hantering
2 Onvoldoende eiwit- en membraanbinding - 20% methanol toevoegen aan de buffer
- Gebruik een membraan met kleine boring
3 Onvoldoende antilichaam - Verhoog de antilichaamconcentratie
4 Onvoldoende antigeen - Laad meer eiwitten
5 Antigeen maskeren door buffer te blokkeren - Vergelijk verschillende blokkeerbuffers
- Optimaliseer de eiwitconcentratie van het blokkerende middel
- Verkort de blokkeertijd
6 Aanwezigheid van natriumazide in buffers - Verwijder natriumazide uit buffers
7 Te korte belichtingstijd - Verleng de belichtingstijd van de film
8 Te korte incubatietijd van het substraat - Verleng de incubatietijd van het substraat tot vijf minuten
9 Vertering van eiwitten op membraan - Optimaliseer de hoeveelheid blokkerende agent
10 Afbraak van eiwitten tijdens opslag - Bereid het eiwitmonster opnieuw voor
11 Incompatibele primaire en secundaire antilichamen - Zorg ervoor dat primair antilichaam, secundair antilichaam, substraat, enzymsysteem en monsters compatibel zijn
- Gebruik laadcontrole om de effectiviteit van het tweede detectiesysteem te testen
12 Lage concentratie van primair antilichaam en / of secundair antilichaam - Verhoog de antilichaamconcentratie
- Verhoog de incubatietijd
13 Kruisreactiviteit tussen blokkerende stof en antilichamen (primair of secundair) - Gebruik een mild schoonmaakmiddel zoals Tween20
- Veranderingsblokker (vaak gebruikt zijn melk, BSA, serum of gelatine)
14 Onvermogen van primair antilichaam om het eiwit in het geteste monster te herkennen - Controleer instructie
- Gebruik positieve controle
15 Laag of geen gehalte aan doeleiwit (ineffectief antigeen) - Gebruik positieve controle
- Verhoog de laadhoeveelheid tot 20-30 µg eiwit per putje
- Gebruik proteaseremmer of fractionele extract-doeleiwit
16 Onvoldoende overdracht en overmatig wassen - Controleer de overdracht met Ponceau S
- Week PVDF-membraan in methanol
- Vermijd overmatig wassen
17 Overmatig blokkeren - Gebruik 0,05% magere melk of geen buffer met melkverdunners
- Verander blokkerende agent
- Verkort de blokkeertijd
18 Verlies van de effectiviteit van primaire antilichamen - Maak verse antilichamen klaar en bewaar ze op de juiste manier wanneer ze niet worden gebruikt
- Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien
19 Remming van secundair antilichaam door natriumazide - Vermijd het gebruik van natriumazide samen met aan HRP geconjugeerde antilichamen
20 Verlies van effectiviteit in enzymconjugaat en substraat - Meng enzymconjugaat en substraat (geen kleurontwikkeling wanneer enzym inactief is)
- Gebruik geactiveerd enzymconjugaat en vers substraat
21 Onjuiste natte overdracht voor membraan - Week het PVDF-membraan in 100% methanol
22 Onvoldoende molecuulgewicht van doeleiwit (<10 kDa) - Gebruik een membraan met kleine boring
- Overdrachttijd verkorten
23 Gelijkheid of nabijheid in waarden tussen het iso-elektrische punt van het doeleiwit en de pH-waarde van de transferbuffer - Probeer andere buffers zoals CAPS-buffer (pH 10,5)
- Probeer buffers met een lage pH-waarde, zoals azijnzuurbuffer
24 Te hoge methanolconcentratie - Verlaag de methanolconcentratie of gebruik isopropylalcohol