Flowcytometrie algemeen protocol

Flowcytometrie Beckton Dickinson FacsCalibur

I. Benodigd materiaal

  1. Reagentia
    – Een primair antilichaam , tegen het doelmolecuul
    – Een Fc-receptorblokker: «Anti-CD16 / 32, blokkeert Fc-binding» die niet-specifiek primaire antilichamen bindt
    – Een secundair antilichaam in geval van indirecte kleuring met een niet-gelabeld primair antilichaam
    – A niet-relevant controle-isotype met een vergelijkbaar label als primair antilichaam
  2. Buffers
    – Een kleuringsbuffer
    – Een intracellulaire fixatiebuffer
    – Trypanblauw voor het tellen van cellen
    – Gaines-omhulselvloeistof
  3. Materiaal
    – Pipetten en pipethulp
    – Centrifugator
    – Vriezer
    – Flowcytometer

II. Experimenteer lengte

– 30 minuten monstervoorbereiding en antilichaamverdunningen
– 30 minuten tot 1 uur incubatie van antilichamen
– 30 minuten tot 1 uur aflezen van monsters met de flowcytometer (afhankelijk van het aantal monsters, de celconcentratie en de capaciteit van de cytometer)
– TOTAAL: 3 tot 4 uur

III. Protocol

– Verdun primair antilichaam en controle-isotype in 50 µl assaybuffer om de gewenste concentratie te respecteren die is geoptimaliseerd na antilichaamtitratie
– Incubeer 50 µl celpreparaat in 50 µl antilichaambereiding of controle-isotype in een plaat met 96 putjes
– Incubeer gedurende 15 -30 min bij 4 ° c in een donkere kamer

Notitie: U moet de incubatietijd van antilichamen optimaliseren met betrekking tot hun affiniteit met het antigeen.

– Voeg 200 µl assaybuffer toe om de reactie te stoppen
– Centrifugeer de cel in suspensie gedurende 5 minuten (300 – 400 g) bij + 4 ° C en gooi het supernatant weg
– Herhaal tweemaal de wasstappen met 200 µl assaybuffer – Centrifugeer celsuspensie gedurende 5 minuten min (300 – 400 g) bij 4 ° c

Optioneel: Herhaal voor indirecte kleuring de kleuringsstap met secundair antilichaam met hetzelfde protocol en vergelijkbare waarnemingen
– Resuspendeer in 500 µl assaybuffer of fixatiebuffer aangevuld met 2% formaldehyde
– Lees cellen af ​​in een flowcytometer

  1.  Primaire antilichamen
  2. Secundaire antilichamen