Protein Electrophoresis

Eiwitelektroforese

Abstract

Polyacrylamidegelelektroforese in aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat (SDS-PAGE) is een veel voorkomende techniek die wordt gebruikt voor de analyse van complexe mengsels van polypeptiden. Het heeft een groot oplossend vermogen, is snel en is geschikt voor eiwitten van zowel zure als basische pI. De laatste is omdat het eiwit reageert met SDS, dat zich aan het eiwit bindt in de geschatte verhouding 1∶4∶1 (SDS:eiwit, w/w) en een negatieve lading geeft aan het SDS-eiwitcomplex. De geladen complexen verplaatsen zich naar de anode wanneer ze in een elektrisch veld worden geplaatst en worden gescheiden op basis van verschillen in lading en grootte. SDS-PAGE wordt vaak gebruikt om de molecuulgewichten van eiwitten te schatten, maar schattingen zijn bij benadering (worden “schijnbare molecuulgewichten” genoemd) en zijn soms vatbaar voor duidelijke fouten.

Er kunnen bijvoorbeeld onevenredig grote toenames van het schijnbare molecuulgewicht optreden bij covalente fosforylering van een eiwit ( 1 ) of kunstmatige insluiting van fosforzuur ( 2 ). De meeste ontwerpen van SDS-PAGE maken gebruik van een “stapelgel”. Een dergelijk systeem maakt concentratie van monsters van relatief grote volumes tot zeer kleine zones binnen de gel mogelijk, waardoor smalle banden van de verschillende eiwitten ontstaan, die dan beter worden opgelost.

Het principe dat betrokken is bij deze eiwitconcentratie (of “stapelen”) is dat van isotachoforese. Het wordt opgezet door een stapelgel te maken bovenop de “scheidingsgel”, die een andere pH heeft. Het monster wordt aangebracht op de stapelgel en wanneer het elektrische veld wordt toegepast, bewegen de negatief geladen complexen en kleinere ionen naar de anode.

Eiwitscheidingsmethoden
Het volgende is een kort overzicht van enkele veelvoorkomende methoden die worden gebruikt voor eiwitscheiding
:
SDS-PAGE (SDS-polyacrylamidegelelektroforese) scheidt eiwitten voornamelijk
op basis van molecuulgewicht in tegenstelling tot lading (die wordt ‘uitgedompeld’
door de overmaat aan eiwitgebonden SDS) of vouwing (eiwitten worden grotendeels gedenatureerd in
SDS).

Protein sequencing
Protein sequencing

Wat is eiwitelektroforese?

Eiwitelektroforese is een standaard laboratoriumtechniek waarmee geladen eiwitmoleculen door een elektrisch veld door een oplosmiddel worden getransporteerd. Zowel eiwitten als nucleïnezuren kunnen worden gescheiden door elektroforese, wat een eenvoudig, snel en gevoelig analytisch hulpmiddel is. De meeste biologische moleculen dragen een netto lading bij elke andere pH dan hun iso-elektrisch punt en zullen migreren met een snelheid die evenredig is aan hun ladingsdichtheid. De mobiliteit van een molecuul door een elektrisch veld hangt af van de volgende factoren: veldsterkte, nettolading op het molecuul, grootte en vorm van het molecuul, ionsterkte en eigenschappen van de matrix waardoor het molecuul migreert (bijv. viscositeit, porie grootte). Polyacrylamide en agarose zijn twee dragermatrices die vaak worden gebruikt bij elektroforese. Deze matrices dienen als poreuze media en gedragen zich als een moleculaire zeef. Agarose heeft een grote poriegrootte en is geschikt voor het scheiden van nucleïnezuren en grote eiwitcomplexen. Polyacrylamide heeft een kleinere poriegrootte en is ideaal voor het scheiden van de meeste eiwitten en kleinere nucleïnezuren.

Er bestaan ​​verschillende vormen van polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) en elke vorm kan verschillende soorten informatie verschaffen over eiwitten van belang. Denatureren en reduceren van natriumdodecylsulfaat PAGE (SDS-PAGE) met een discontinu buffersysteem is de meest gebruikte elektroforesetechniek en scheidt eiwitten voornamelijk op massa. Niet-denaturerende PAGE, ook wel native-PAGE genoemd, scheidt eiwitten op basis van hun massa/ladingsverhouding. Tweedimensionale (2D) PAGINA scheidt eiwitten op natief iso-elektrisch punt in de eerste dimensie en op massa in de tweede dimensie.

[Linking template=”default” type=”products” search=”Protein Electrophoresis” header=”3″ limit=”18″ start=”1″ showCatalogNumber=”true” showSize=”true” showSupplier=”true” showPrice=”true” showDescription=”true” showAdditionalInformation=”true” showImage=”true” showSchemaMarkup=”true” imageWidth=”” imageHeight=””]