| S.No. |
Mogelijke oorzaak |
Oplossing |
| 1 |
Onjuiste eiwitoverdracht naar membraan |
- Vlekgel nadat de overdracht is voltooid om te bepalen of de overdracht efficiënt is
- Gebruik Ponceau S om het membraan te kleuren om te bepalen of de overdracht efficiënt is
- Zorg voor voldoende contact tussen gel en membraan tijdens overdracht
- Zorg ervoor dat de transfersandwich correct is gemonteerd
- Nat membraan volgens de instructie
- Vermijd oververhitting tijdens elektro-overdracht
- Gebruik positieve markeringen voor controle of molecuulgewicht
- Overdrachtstijd en -stroom optimaliseren
- Gebruik Boster’s membraanoverdrachtbuffer (AR1149)
- Vermijd vernietiging van monsters (antigene determinant) bij hantering
|
| 2 |
Onvoldoende eiwit- en membraanbinding |
- 20% methanol toevoegen aan de buffer
- Gebruik een membraan met kleine boring
|
| 3 |
Onvoldoende antilichaam |
- Verhoog de antilichaamconcentratie
|
| 4 |
Onvoldoende antigeen |
|
| 5 |
Antigeen maskeren door buffer te blokkeren |
- Vergelijk verschillende blokkeerbuffers
- Optimaliseer de eiwitconcentratie van het blokkerende middel
- Verkort de blokkeertijd
|
| 6 |
Aanwezigheid van natriumazide in buffers |
- Verwijder natriumazide uit buffers
|
| 7 |
Te korte belichtingstijd |
- Verleng de belichtingstijd van de film
|
| 8 |
Te korte incubatietijd van het substraat |
- Verleng de incubatietijd van het substraat tot vijf minuten
|
| 9 |
Vertering van eiwitten op membraan |
- Optimaliseer de hoeveelheid blokkerende agent
|
| 10 |
Afbraak van eiwitten tijdens opslag |
- Bereid het eiwitmonster opnieuw voor
|
| 11 |
Incompatibele primaire en secundaire antilichamen |
- Zorg ervoor dat primair antilichaam, secundair antilichaam, substraat, enzymsysteem en monsters compatibel zijn
- Gebruik laadcontrole om de effectiviteit van het tweede detectiesysteem te testen
|
| 12 |
Lage concentratie van primair antilichaam en / of secundair antilichaam |
- Verhoog de antilichaamconcentratie
- Verhoog de incubatietijd
|
| 13 |
Kruisreactiviteit tussen blokkerende stof en antilichamen (primair of secundair) |
- Gebruik een mild schoonmaakmiddel zoals Tween20
- Veranderingsblokker (vaak gebruikt zijn melk, BSA, serum of gelatine)
|
| 14 |
Onvermogen van primair antilichaam om het eiwit in het geteste monster te herkennen |
- Controleer instructie
- Gebruik positieve controle
|
| 15 |
Laag of geen gehalte aan doeleiwit (ineffectief antigeen) |
- Gebruik positieve controle
- Verhoog de laadhoeveelheid tot 20-30 µg eiwit per putje
- Gebruik proteaseremmer of fractionele extract-doeleiwit
|
| 16 |
Onvoldoende overdracht en overmatig wassen |
- Controleer de overdracht met Ponceau S
- Week PVDF-membraan in methanol
- Vermijd overmatig wassen
|
| 17 |
Overmatig blokkeren |
- Gebruik 0,05% magere melk of geen buffer met melkverdunners
- Verander blokkerende agent
- Verkort de blokkeertijd
|
| 18 |
Verlies van de effectiviteit van primaire antilichamen |
- Maak verse antilichamen klaar en bewaar ze op de juiste manier wanneer ze niet worden gebruikt
- Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien
|
| 19 |
Remming van secundair antilichaam door natriumazide |
- Vermijd het gebruik van natriumazide samen met aan HRP geconjugeerde antilichamen
|
| 20 |
Verlies van effectiviteit in enzymconjugaat en substraat |
- Meng enzymconjugaat en substraat (geen kleurontwikkeling wanneer enzym inactief is)
- Gebruik geactiveerd enzymconjugaat en vers substraat
|
| 21 |
Onjuiste natte overdracht voor membraan |
- Week het PVDF-membraan in 100% methanol
|
| 22 |
Onvoldoende molecuulgewicht van doeleiwit (<10 kDa) |
- Gebruik een membraan met kleine boring
- Overdrachttijd verkorten
|
| 23 |
Gelijkheid of nabijheid in waarden tussen het iso-elektrische punt van het doeleiwit en de pH-waarde van de transferbuffer |
- Probeer andere buffers zoals CAPS-buffer (pH 10,5)
- Probeer buffers met een lage pH-waarde, zoals azijnzuurbuffer
|
| 24 |
Te hoge methanolconcentratie |
- Verlaag de methanolconcentratie of gebruik isopropylalcohol
|
)
)
)
)
)
)
 (pORF))
 (pORF))
 (pORF))
)
)
)
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 Antibody)
)
)
)
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
)
)
)
)
)
)
 Antibody)
 (pORF))
 (pORF))
 (pORF))
)
)
)
)
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 ELISA kit)
)
)
)
 (pORF))
 (pORF))
 (pORF))
)
)
)
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (Target 1))
 (Target 2))
 (Target 3))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 (pPB-C-His))
 (pPB-N-His))
 (pPM-C-HA))
 (pPM-C-His))
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 ELISA kit)
 Antibody)
 Antibody)
 Antibody)
)
)
)
 Antibody)
 Antibody)
 Blocking Peptide)
 Antibody)
)
)
)
 Blocking Peptide)
 Polyclonal Antibody)
 Antibody)
 (pORF))
 (pORF))
 (pORF))
 antibody)
 Antibody)