Western Blot
Western blot-protocol
Benodigde producten:
Primaire antilichamen
Secundaire antilichamen
Loopbuffer: H2O, Tris-Glycine , SDS
Overdrachtsbuffer: H2O, Tris-Glycine , EtOH / MeOH, SDS
Acrylamide-gels: H2O, Acrylamide , Tris HCl , SDS , APS , TEMED
Voorgegoten gels
Controle gewicht ladders
Laemmli-monsterbuffer
verdunning buffer
Blokkeerbuffer: met of zonder BSA , op basis van caseïne
wassen buffer
Coating buffer
Strippen buffer
Eiwitkleuring : snelle coomassie , real-time kleuring
Membranen: PVDF , nitrocellulose , nylon
Vloeipapier
Western blot-substraten
Rouge Ponceau
Eiwitbereiding en scheiding door gelelektroforese
Verwijder een klein volume eiwitmonster om de eiwitconcentratie te bepalen
Neem 20 µg eiwitten en voeg Laemmli toe
Kook 5 minuten op 95 ° C en draai de buisjes rond
Laad een gelijk volume van eiwitten in de putjes van de SDS-PAGE-gel (acrylamide% hangt af van de grootte van het doeleiwit), en vergeet niet een putje voor controlegewichtladders.
Migratie bij constante stroomsterkte met geschikte buffer
Eiwittransport van de gel naar het membraan
Plaats de sandwich (gel / membraan / vloeipapier) in de transferdoos en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in zitten
Overdracht bij constante spanning met de juiste buffer
Antilichaam incubatie en visualisatie
Kleur het membraan met Ponceau-rood om de kwaliteit van de eiwitoverdracht te controleren
Spoel het membraan af en incubeer in een blokkerende oplossing
Incubeer ’s nachts met het primaire antilichaam bij 4 ° C
Spoel de vlek uit
Incubeer met het secundaire antilichaam 1 uur bij kamertemperatuur
Rincer la membraan
Breng het substraat aan op de vlek
-
BEREIDING VAN GELEVERDE REAGENTIA PLAATLEZER
VOORZORGSMAATREGELEN EN VEILIGHEID De ELISA-tests zijn tijd- en temperatuurgevoelig. Om onjuiste resultaten te voorkomen, volgt u strikt de stappen van de testprocedure en wijzigt u deze niet. Wissel geen reagentia…
-
Onze aanbevolen producten
Elisa kits USCN Life sciences biedt meer dan 5000 Elisa-kits voor analyse van verschillende cytobinls-groeifactoren in serum, plasma, weefselhomogentis, celcysaten, celkweek-supermaten en andere biologische vloeistoffen van mensen, ratten, muizen…