Anti-SARS-CoV-2 nucleocapsid protein

OVERZICHT

In december 2019 is in Wuhan, China, een nieuw coronavirus geïdentificeerd, dat nu officieel de naam heeft gekregen van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), dat de uitbraak veroorzaakte van een coronavirus-geassocieerde acute respiratoire aandoening, coronavirusziekte genaamd 19 ( COVID-19), Tekenen en symptomen van COVID-19 kunnen 2 tot 14 dagen na infectie optreden, waaronder koorts, hoesten, kortademigheid of ademhalingsmoeilijkheden, spierpijn en vermoeidheid.

In ernstige gevallen kan de infectie verder leiden tot longontsteking, ernstig acuut ademhalingssyndroom (SARS), nierfalen en overlijden. Nucleocapsid-eiwit (NP) is het meest voorkomende eiwit op het spiraalvormige nucleocapside van coronavirussen, dat het hele genomische RNA omhult.

NP interageert ook met andere virale structurele eiwitten om een belangrijke rol te spelen tijdens het binnenkomen van de gastheercel en de assemblage en afgifte van virusdeeltjes. Van anti-NP-antilichamen is aangetoond dat ze de eerste en de meest voorkomende antilichamen zijn die na coronavirusinfectie in bloedmonsters van patiënten kunnen worden gedetecteerd.

gentaur.be
gentaur.be

Assayprincipe

ImmunoDiagnostics SARS-CoV-2 NP IgG ELISA-kit is een tweestaps incubatie-immunoassay-kit.

Recombinant nucleocapside-eiwit (NP) van SARS-CoV-2 dat vooraf op de polystyreen microwell-strips is gecoat, kan specifiek anti-NP-antilichamen in menselijke serum- of plasmamonsters herkennen. Na een incubatie van 1 uur worden anti-NP-antilichamen opgevangen door geïmmobiliseerd NP-eiwit terwijl de ongebonden componenten worden weggespoeld.

Daarna wordt een detectieoplossing die HRP-geconjugeerd anti-humaan IgG bevat toegevoegd voor nog een incubatie van 1 uur, waarbij HRP-geconjugeerd anti-humaan IgG bindt aan de IgG-klasse antilichamen die eerder aan NP-eiwit op de plaat waren gebonden. Na het verwijderen vanniet-specifieke bindingen, wordt een HRP-substraatoplossing toegevoegd die 3,3 ‘, 5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) bevat, wat resulteert in de vorming van een blauwe kleur.

De kleurreactie wordt gestopt door 2M H 2 ZO 4, het transformeren van de blauwe kleur naar gele signalen, die wordt gekwantificeerd door een absorptie-microtiterplaatlezer bij 450 nm. De kleurintensiteit is evenredig met de hoeveelheid anti-NP-antilichamen die in de putjes zijn gevangen.

MEEGELEVERDE REAGENTIA EN MATERIALEN

 

 

 

 

EEN

 

 

SARS-CoV-2

NP-gecoate ELISA-plaat

12 strips van 8 wells (96 wells in totaal) in een witte striphouder en verzegeld in een foliezakje met droogmiddel. Elk putje bevat recombinant NP van SARS-CoV-2. De microwell-strips kunnen afzonderlijk worden gebruikt. Plaats ongebruikte putten of

strips in de meegeleverde plastic verzegelbaar

 

opbergtas samen met het droogmiddel en terug naar 2-8 ° C. Eenmaal geopend, stabiel gedurende 4 weken bij 2-8 ° C.
B 5x assaybuffer 1 x 20 ml
C 10x wasbuffer 1 x 40 ml
 

D

100x

detectie-antilichaamoplossing

1 x 0,12 ml
E Substraat oplossing 1 x 12 ml
F Stop oplossing 1 x 12 ml
G Blanco controle 1 x 1 ml
 

H

Positieve controle (anti-NP IgG)  

1 injectieflacon

 

gentaur.be
gentaur.be

MATERIALEN VEREIST, MAAR NIET MEEGELEVERD

  • Pipetten en pipetpunten.
  • 96-wells plaat of handmatige
  • Buffer- en
  • Papieren handdoeken of absorberend
  • Een microplaatlezer die het absorptievermogen bij 450 nm kan
  • Gedestilleerd water of gedeïoniseerd

OPSLAG EN BEREIDING VAN TESTSTALEN

  • Er wordt gesuggereerd dat testmonsters onmiddellijk na scheiding van serum of plasma worden geanalyseerd of bij voorkeur bevroren worden bewaard (-20 0 C of lager) in Meerdere cycli van invriezen en ontdooien moeten worden vermeden. Dubbele test wordt aanbevolen.
  • Serum- of plasmamonsters met EDTA, natriumcitraat of heparine kunnen worden getest. Sterk lipemische, icterische of hemolytische monsters worden niet aanbevolen. Monsters met zichtbare microbiële besmetting mogen niet worden gebruikt.

 

  • Indien nodig, vortex-testserum of plasmamonsters bij kamertemperatuur om homogeniteit te garanderen. Centrifugeer vervolgens monsters bij10.000 tot 15.000 tpm gedurende 5 minuten voorafgaand aan de assay om deeltjes te verwijderen. Sla deze centrifugatiestap niet over als de monsters troebel zijn en deeltjes bevatten.

OPSLAG EN STABILITEIT

  • De kit is alleen stabiel tot de vervaldatum indien bewaard bij 2-8 ° C in verzegelde De vervaldatum is de laatste dag van de maand die staat vermeld op het foliezakje en de kitcontainer.
  • De kit moet bij ontvangst bij 2-8 ° C worden bewaard en alle reagentia moeten vóór gebruik op kamertemperatuur worden gebracht. Verwijder alle ongebruikte stroken met antigeencoating van de microtiterplaat, doe ze terug in het foliezakje en sluit opnieuw af. Eenmaal geopend, kunnen de strips maximaal een maand bij 2-8 ° C worden bewaard.
  • Bescherm de reagentia tijdens opslag tegen verontreiniging met micro-organismen of chemicaliën om maximale prestaties te garanderen.

 

gentaur.be
gentaur.be

 

·        Bewaar de positieve controle bij 4 graden, tot 3 maanden.

 

BEREIDING VAN MEEGELEVERDE REAGENTIA

  1. 1 ×Bereid 1x
    assaybuffer door de 5x assaybuffer (20 ml) te mengen met 80 ml gedestilleerd water of gedeïoniseerd water. 【 VOORZICHTIGHEID!!! 】 Als er neerslagen worden waargenomen in de 5x assay-bufferfles, verwarm de fles dan in een waterbad van 37 ° C totdat de neerslagen verdwijnen. Een onvolledige oplossing leidt tot een hoge achtergrond. De 1x assay-buffer kan maximaal een maand bij 2-8 ° C worden bewaard.
  1. 1xWash-buffer
    Bereid 1xWash-buffer door de 10xWash-buffer (40ml) te mengen met 360ml gedestilleerd water of gedeïoniseerd water. VOORZICHTIGHEID!!! Als neerslagen worden waargenomen in de 10xWash-bufferfles, verwarm de fles in een  waterbatch van 37 ° C totdat de neerslagen verdwijnen.  Een onvolledige oplossing leidt tot een hoge achtergrond. De 1xWash-buffer kan maximaal een maand bij 2-8 ° C worden bewaard.

3. 1x detectie-antilichaamoplossing

Draai de 100 × detectie-antilichaamoplossing kort neer en verdun de gewenste hoeveelheid antilichaam 1: 100 met 1 × assaybuffer, 100 m 1 putje van de 1 × detectie-antilichaamoplossing is vereist per putje. Bereid slechts zoveel 1 ×detectie-antilichaamoplossing als nodig  is.                  Lever de … In 100 × detectie-antilichaamoplossing tot 2-8 ° C onmiddellijk nadat het benodigde volume is verwijderd.

  1. Voorbereiding van positieve controle
    Centrifugeer het kort voordat u de buis opent . Voeg 200 µl 1xAssay-buffer toe aan elke buis en meng goed.

MONSTERVOORBEREIDING

Serum- of plasmamonster is over het algemeen vereist een 100-voudige verdunning in de 1 × assaybuffer. Een voorgestelde verdunningsstap is om 10 µl monster toe te voegen aan 990 µl 1 × assaybuffer. De verdunningsfactor kan worden aangepast op basis van de titer van de antilichamen in de monsters.

 

gentaur.be
gentaur.be

ASSAYPROCEDURES

Stel alle reagentia vóór gebruik ten minste 30 minuten op kamertemperatuur (20-25 ° C).

 

 

Stap 1

Controles en specimen toevoegen:

Voeg 100 μl specimen, 100 μl blanco controle en 100 μl positieve controle toe aan hun respectievelijke putjes. Dubbele test wordt aanbevolen.

Opmerking: gebruik voor elke test een afzonderlijke pipetpunt om afvalbesmetting te voorkomen. Meng door zachtjes op de plaat te tikken.

 

Stap 2

Incubatie:

Bedek de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.

 

Stap 3

Wassen:

Gooi de inhoud weg en tik op de plaat op een schone papieren handdoek om de

resterende oplossing in elk putje te verwijderen. Voeg 300 toe

µl 1 × wasbuffer in elk putje en incubeer gedurende 1

 

minuut. Gooi de 1 × wasbuffer weg en tik op de plaat op een schone papieren

handdoek om de resterende wasbuffer te verwijderen. Herhaal de wasstap voor in totaal 3 wasbeurten.

Stap 4 HRP- geconjugeerde detectieoplossing toevoegen:

Voeg aan elk putje 100 µl 1 × detectieoplossing toe.

 

Stap 5

Incubatie:

Bedek de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.

Stap 6 Wa ssen:

Was elk putje 4 keer zoals beschreven in stap 3.

 

Stap 7

Kleur:

Voeg 100 µl substraatoplossing toe aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Bescherm tegen licht.

Stap 8 Rea ctie stoppen:

Voeg 100 µl stopoplossing toe aan elk putje en tik zachtjes gedurende enkele

seconden op het plaatframe om een grondige menging te garanderen.

 

Stap 9

Meting:

Meet onmiddellijk de absorptie van elk putje bij 450 nm. Let op: lees de absorptie binnen 10 minuten na het stoppen van de reactie.

 

KWALITEITSCONTROLE

Elke microtiterplaat moet afzonderlijk worden overwogen bij het berekenen en interpreteren van de resultaten van de assay, ongeacht het aantal gelijktijdig verwerkte platen.

De testresultaten zijn geldig als aan de criteria voor kwaliteitscontrole is voldaan. Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium een geschikt systeem voor kwaliteitscontrole instelt met materiaal voor kwaliteitscontrole dat vergelijkbaar is met of identiek is aan het te analyseren patiëntspecimen.

  • De absorptiewaarde van de blanco-controle moet <0,170 bij 450 nm
  • De absorptiewaarde van de positieve controle moet> 0,500 bij 450 nm

TYPISCHE RESULTATEN

Monsters OD450
 

Blanco controle

0.117
0,126
 

Positieve controle

0.737
0.759
 

Serum van gezonde proefpersonen

0,126
0,15
0.197
Serum van COVID-19

patiënten

1.373
2.024
0,582

 

–  Klinische validatiestudie van ImmunoDiagnostics SARS-CoV-2 NP IgG ELISA werd uitgevoerd in 2020 in Shenzhen, China. Monsters werden verzameld uit door COVID-19 bevestigde gevallen met klinische symptomen, laboratoriumafwijkingen of manifestaties van pulmonale beeldvorming. Er zijn geen tests uitgevoerd op monsters van latente infecties of patiënten in

 

de incubatietijd. De kit vertoonde een hoger positief detectiepercentage bij monsters van patiënten met een vertraagd begin. Daarom moet bij de interpretatie van de testresultaten rekening worden gehouden met de verzameltijd van het monster.

–  Het wordt ten zeerste aanbevolen dat elk laboratorium zijn eigen normale en pathologische referentiebereik voor het anti-NP IgG-niveau vaststelt. Bovendien wordt ook aanbevolen dat elk laboratorium zijn eigen panel controlemonsters in de assay opneemt.

 

gentaur.be
gentaur.be

PRESTATIEKENMERKEN

Gevoeligheid 93,33% (n = 60)
Specificiteit 93,89% (n = 180)
Inter Assay Precision
Samples CV
1 5,46%
2 6,75%
3 6,16%
Precisiemonsters Intra
Assay CV
1 4,93%
2 5,52%
3 5,68%

VOORZORGSMAATREGELEN EN VEILIGHEID

De ELISA-tests zijn tijd- en temperatuurgevoelig. Volg de stappen van de testprocedure strikt om onjuiste resultaten te voorkomen.

 

  1. Wissel geen reagentia uit verschillende partijen uit en gebruik geen reagentia uit andere in de handel verkrijgbare kits. De componenten van de kit zijn nauwkeurig op elkaar afgestemd voor een optimale uitvoering van de tests.
  2. Zorg ervoor dat alle reagentia binnen de geldigheidsduur vallen die op de kitdoos en van dezelfde partij is aangegeven. Gebruik nooit reagentia na de vervaldatum vermeld op etiketten of
  1. VOORZICHTIG – KRITISCHE STAP: Laat de reagentia en monsters vóór gebruik op kamertemperatuur (20-25 ° C) komen. Reagens voorzichtig schudden voor gebruik. Direct na gebruik terugbrengen bij 2-8 °
  2. Gebruik alleen voldoende volume van het monster zoals aangegeven in de Als u dit niet doet, kan dit een lage gevoeligheid van de test veroorzaken.
  3.  Raak de buitenbodem van de putten niet aan; vingerafdrukken of krassen kunnen het lezen verstoren. Zorg er bij het lezen van de resultaten voor dat de bodem van de plaat droog is en dat er geen luchtbellen in de putjes zijn.
  1. Laat de microtiterplaatwells na de wasstap nooit Ga onmiddellijk door naar de volgende stap. Vermijd de vorming van luchtbellen bij het toevoegen van de reagentia.
  1. Vermijd langdurige onderbrekingen van Zorg voor dezelfde arbeidsomstandigheden voor alle putten.
  2. Kalibreer de pipet regelmatig om de nauwkeurigheid van de verstrekking van monsters / reagentia te verzekeren. Gebruik voor elk monster en reagentia verschillende pipetpunten voor verwijdering om kruisbesmetting te
  3.  Raak bij het toevoegen van monsters de bodem van de put niet aan met de pipetpunt.
  1. Bepaal bij het meten met een plaatlezer de absorptie bij 450 nm of bij 450/600

~ 650 nm.

  1. De enzymatische activiteit van het HRP-conjugaat kan worden beïnvloed door stof en reactieve chemicaliën en stoffen zoals natriumhypochloriet, zuren, logen, Voer de test niet uit in aanwezigheid van deze stoffen.
  1. Alle monsters van menselijke oorsprong moeten als potentieel infectieus worden beschouwd. Strikte naleving van GLP-regels (Good Laboratory Practice) kan de persoonlijke veiligheid garanderen.
  2. Eet, drink, rook of breng nooit cosmetica aan in het testlaboratorium. Pipetteer nooit oplossingen via de mond.
  3. Chemische stoffen mogen alleen worden gehanteerd en verwijderd in overeenstemming met de huidige GLP (Good Laboratory Practices) en de lokale of nationale
  1. De pipetpunten, flacons, strips en monsterhouders moeten worden verzameld en geautoclaveerd gedurende minimaal 2 uur bij 121 ° C of behandeld met 10% natriumhypochloriet gedurende 30 minuten om te ontsmetten voordat verdere verwijderingsstappen worden Oplossingen die natriumhypochloriet bevatten, mogen NOOIT worden geautoclaveerd. Material Safety Data Sheet (MSDS) beschikbaar op aanvraag.
  1. Sommige reagentia kunnen als grondstof toxiciteit, irritatie, brandwonden of carcinogene effecten Contact met de huid en het slijmvlies moet worden vermeden, maar is niet beperkt tot de volgende reagentia: de stopoplossing, de substraatoplossing en de wasbuffer.
  1. De stopoplossing 2M H 2 ZO 4 is een Gebruik het met gepaste zorg. Veeg gemorste vloeistoffen onmiddellijk op en was ze met water als ze in contact komen met de huid of ogen.
  1. ProClinTM 300 0,1% als conserveermiddel gebruikt, kan huidgevoel veroorzaken. Veeg gemorste vloeistoffen onmiddellijk op of was ze met water als ze in contact komen met de huid of